Hierdoor was Röntgen gedwongen om ergens anders te gaan studeren. Uiteindelijk heeft hij gekozen voor de richtinge natuurkunde aan de universiteit van Utrecht waar hij in 1965 aan zijn opleiding begon. Hier studeerde hij ingenieurswetenschappen. In 1869 behaalde hij zijn doctoraat aan de universiteit van Zurich en drie jaar later ging hij naar Straatsburg.

Röntgens eerste werk werd gepubliceerd in 1870, en ging over het verhitten van gassen. Dit werk werd een aantal jaar later opgevolg door een thesis over de warmte geleidendheid van kristallen. Onder andere problemen bevonden zich ook nog de elektrische karakteristieken van quartz (gebruikt in bv polshorloges); de invloed van druk op de brekingsindex van verscheidene vloeistoffen; en het fenomeen van de verspreiding van oliedruppels in water.

Röntgens naam wordt echter nog het meest geassocieerd met zijn ontdekking van straling die hij X-stralen noemde. In 1895 was hij het fenomeen aan het bestuderen dat te maken heeft met de passage van een elektrische stroom door een gas met een extreem lage druk (bijna vacuüm dus). Zo'n werk was al eerder gedaan, bijvoorbeeld door Ruhmkorff (de inductieklos). Röntgens werk over kathode stralen leidde hem echter tot een heel andere ontdekking van een nieuw soort straling.

Op 8 November 1895, 's avonds, ontdekte hij dat als een ontladingsbuis afgesloten zit in een stevige zwarte doos die geen licht doorlaat, en dat als hij in een donkere ruimte werkte, een papieren plaat die langs één kant met bariumplatinocyanide bekleed was (in die tijd veel gebruikt als fotoplaat) en in het pad van de stralen stond, fluorescent werd zelfs al stond ze tot twee meter van de bron vandaan. Tijdens volgende experimenten ontdekte hij dat objecten van variërende dikheid een variërende transparantheid haddden in combinatie met de x-stralen. Wanneer hij de hand van zijn vrouw voor de plaat hield, was het resultaat een duidelijke afbeelding van de beenderen in de hand. Beenderen laten dus met andere woorden geen x-stralen door, het weefsel erond dus wel. Dit was de eerste röntgenfoto die ooit was genomen. In verdere experimenten bewees Röntgen dat de nieuwe straling geproduceerd werd door het invallen van kathodestralen op een zeker object. Omdat de aard van de stralen onbekend was, gaf hij ze de naam 'X-stralen'. Later bewezen Max von Laue en zijn leerlingen dat ze van dezelfde elektromagnetische samenstelling waren als licht, maar een hogere frequentie hadden.

Verscheidene eerbetuigingen werden aan hem gegeven. In verschillende steden werden straten naar hem genoemd, en de complete lijst van prijzen, medailles, eredoctoraten, en andere eervolle aanbeidingen zou langer zijn dan dit artikel. Röntgen behield echter het karakter van een zeer bescheiden man, en dus zichzelf. Doorheen zijn leven verkreeg hij de liefde voor de natuur en buitendeurse activiteiten. Veel van zijn vakanties werden besteed in zijn zomerhuisje in Weilheim, aan de voet van de Beirse alpen, waar hij zijn vrienden onderhield en meer dan eens in gevaarlijke situaties terecht kwam. Vriendschappelijk als hij was, begreep hij altijd de standpunten en problemen van anderen. Wel was hij altijd een beetje verlegen om een assistent in dienst te nemen, en prefereerde hij alleen te werken. Veel van zijn instrumenten waren door hemzelf gebouwd met een verbazingwekkende nauwkeurigheid. Röntgen trouwde met Anna Bertha Ludwig uit Zürich, die hij had ontmoet in een café dat door haar vader gedraaid werd. In 1872 trouwden ze in Apeldoorn, in Nederland. Ze hadden geen kinderen, maar in 1887 adopteerden ze Josephine Bertha Ludwig, nicht van mvr Röntgen zelf. Röntgen stierf op 10 Februari 1923, 4 jaar na zijn vrouw, aan kanker.